血管内皮S1pr1通过刺激心肌梗死后修复性巨噬细胞增殖改善不良心脏重塑

• 摘要
  • 内皮细胞(EC)稳态在正常的生理心功能中起重要作用，其功能紊乱对心肌梗死(MI)后病理性心脏重塑有显著影响。研究表明，鞘氨醇1-磷酸酯受体1 (S1pr1)在ECs中高度表达，在维持内皮功能中发挥重要作用。因此，我们假设内皮S1pr1可能参与MI后心脏重塑。
  • 我们的研究表明内皮S1pr1的特异性丢失加剧了心肌梗死后的心脏重构，并加重了心功能障碍。我们发现内皮S1pr1的丢失显著减少了Ly6clow巨噬细胞的积累，这对于心肌梗死后炎症的解决和心脏愈合至关重要。心肌梗死后心肌中修复性巨噬细胞的减少导致 内皮S1pr1缺乏 对心肌梗死后心脏重构的不利影响。进一步的研究表明，内皮S1pr1的缺失 降低了Ly6clow巨噬细胞的增殖，而S1pr1的药物激活增强了Ly6clow巨噬细胞的增殖，从而改善了心肌梗死后的心脏重构。一项机制研究表明，S1pr1激活ERK信号通路，增强集落刺激因子1 (CSF1)表达，以细胞接触方式促进Ly6clow巨噬细胞增殖。CSF1信号传导的阻断逆转了S1pr1激活对Ly6clow巨噬细胞增殖的增强作用，并使心肌梗死后的心脏重构恶化。
  • 本研究显示，心脏微血管内皮通过S1P/S1PR1/ERK/CSF1途径促进损伤心脏中修复性巨噬细胞增殖，从而改善MI后不良心脏重塑。
• Introduction:
  • 从促炎巨噬细胞向修复性巨噬细胞的转变发生在MI后第4-7天，修复性巨噬细胞的特征是高表达F4/80，但低表达Ly6c。局部F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞在损伤心肌中进一步增殖扩张，有助于炎症消退和MI4后的心脏愈合。有人认为，心脏局部微环境可能参与F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞增殖5的调节，从而协调心肌梗死后炎症与愈合之间的平衡。先前的研究显示，内皮细胞(ECs)为巨噬细胞的选择性生长和分化提供了关键信号，包括巨噬细胞集落刺激因子1(CSF 1)5。心脏微血管内皮细胞是心脏的主要细胞类型，血管微环境对维持正常的心功能和病理性心脏重塑起重要作用。然而，尚不清楚血管微环境是否以及如何调节MI后心脏的单核细胞/巨噬细胞双相反应。
  • 血管内皮细胞与血液中的各种循环因子接触，在时间和空间上调节血管微环境稳态。在这些因素中，1-磷酸鞘氨醇(S1P)已被确定为血液中控制内皮细胞发育、稳定性和功能的关键生物活性脂质6。血液S1P结合其受体，鞘氨醇1-磷酸受体1 (S1pr1)，在血管内皮细胞中高度表达，并激活多种信号通路来调节内皮功能7。已经表明，EC-S1pr1在维持血管稳态中起着重要作用8。考虑到S1 P1 R1在内皮功能控制中的重要作用以及心脏内皮细胞在病理性心脏重构过程中对心脏功能的调节中的关键作用，我们假设EC-S1 P1 R1可能影响心肌梗死后的心脏重构。在这里，我们报道了EC-S1P1R1的特异性丢失恶化了心肌梗死后的心脏重构和心脏功能。我们的研究揭示了EC-S1pr1敲除小鼠心肌梗死后第7天F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞数量的急剧减少，从而解释了EC-S1pr1缺失对心肌梗死后心脏重构的有害影响。我们接下来阐明了EC-S1PR1通过ERK-CSF1信号通路以细胞接触的方式促进F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖。相应地，SEW2871对S1pr1的药理激活显著增强了F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖，从而改善了心肌梗死后的心脏重构和心功能。
• RESULT
  • 急性心肌梗死后内皮S1pr1的缺失使心功能恶化
    • S1pr1表达主要在心脏ECs中表达，S1pr2和S1pr3表达中等
    • 
    • 心肌梗死后，S1pr1、S1pr2和S1pr3在心脏ECs中的表达下调，S1pr1的表达水平远低于S1pr2和S1pr3
    • 此外，我们检测到S1PR1在冠脉内皮细胞中的表达，提示S1PR1在心脏内皮细胞中的表达可能与人类心脏疾病有关。S1PR1和CD31的共免疫染色进一步表明，心脏内皮细胞在细胞表面表达S1PR1，对心肌梗死的反应呈下降趋势
  • 内皮S1 P1-缺失加重MI后病理性心脏重塑
    • 做了EC-specific S1pr1 knockout mice crossing VE-cadherin-CreERT2 line with S1pr1flox/flox mice. （通过Cre鼠）
    • 内皮S1pr1的丧失在生理状态下不影响心脏的形态和功能。 MI后28天
    • 心梗后 敲除和WT对比
    • 内皮S1pr1缺失加重心肌梗死后病理性心脏重构
    • 心肌大小无差异
    • 敲除鼠梗塞边缘区域观察到较低的毛细血管密度
  • 心肌梗死后内皮S1pr1的缺失不影响心肌中中性粒细胞和T淋巴细胞的积累
    • 缺血心肌中炎性细胞的募集决定了MI后病理性心脏重构的程度。在外周血中未观察到T淋巴细胞百分比的改变，表明EC-S1pr1缺失不影响淋巴细胞转运。
    • 
    • 中性粒细胞计数在MI后第1天达到峰值，此后其数量下降，这与之前的研究一致，心肌中无差异
  • Endothelial S1pr1 促进F4/80+Ly6clowin 修复巨噬细胞积聚 在对MI的Mo/Mϕ反应的第二阶段
    • 肌梗死后3天梗死心肌出现Mo/Mϕ峰，（第一阶段）后在MI后7天出现修复性巨噬细胞的后期峰，其代表对MI的Mo/Mϕ反应的第二阶段。流式细胞术分析显示s1pr1ecko中的Mo/Mϕ数与WT小鼠在3天时相似，但与WT小鼠相比在MI后7天显著下降。
    • 在MI后的心肌中，Ly-6chigh促炎Mo/Mϕ早期浸润至梗死边界参与了炎症反应，并且随后Ly-6chigh Mo/Mϕ向Ly-6clow心脏修复巨噬细胞的分化对于后期的心脏修复和重塑至关重要。4据报道，心脏巨噬细胞也可以局部补充自身，有助于MI后炎症的消退和心脏愈合的改善。4我们的结果表明，EC-S1pr1的丢失不影响Mo/Mϕ浸润至心肌中，但可能影响MI后的Mo/Mϕ亚群分化和自我补充。
    • 与WT小鼠相比，S1pr1ECKO小鼠在MI后第7天显示F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞数量急剧下降6.91±0.45倍
    • 心肌梗死后5天，S1pr1ECKO小鼠缺血心肌中Ly6clow修复性巨噬细胞(图3G)的许多特征基因下调。我们进一步证实，与WT小鼠相比，S1pr1ECKO小鼠表现出许多Ly6clow修复性巨噬细胞相关基因的表达水平较低，包括Arg1、Vegf、Tgf-β和IL-1r1(图3H)。
  • 内皮S1pr1调节心梗后F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖
    • 如前所述，F4/80+Ly6clow巨噬细胞来自浸润的Ly6chigh单核细胞和心肌梗死后心肌中常驻巨噬细胞的增殖。4因此，我们测试了EC-S1pr1的丢失是否会影响F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖。我们应用流式细胞术来测量Mo/Mϕ亚群中Ki67(细胞增殖的标志)阳性细胞的百分比。
    • 与WT小鼠相比，S1pr1ECKO小鼠在MI后第3天显示Ki67阳性F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞的百分比没有显著差异(图4A)；而，在S1pr1ECKO小鼠心肌梗死后第7天，观察到Ki67阳性F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞的百分比显著降低(图4B)。
    • 最近的研究表明，F4/80+Ly6clow巨噬细胞来源于循环的Ly6chigh单核细胞和常驻的心脏巨噬细胞。13为了阐明EC-S1pr1是影响浸润的单核细胞来源的巨噬细胞还是心脏常驻的巨噬细胞，我们通过抛物线实验将GFP小鼠和非荧光小鼠的循环连接起来，如图4C所示。与WT对照组相比，在S1pr1ECKO受体小鼠的血液来源的GFP+群体中，观察到Ki67阳性F4/80+Ly6clow巨噬细胞的百分比显著降低，这表明EC-S1PR1可能影响浸润单核细胞来源的巨噬细胞的增殖。然而，在绿色荧光蛋白阴性人群(包括招募单核细胞来源的细胞和心脏常驻细胞)中，突变小鼠和WT小鼠之间Ki67阳性F4/80+Ly6clow巨噬细胞的百分比没有观察到显著差异(图4C)，这表明EC-S1P 1可能不会影响心脏常驻巨噬细胞的增殖。这些结果表明EC-S1pr1可能促进血源性F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖，但不增加心脏常驻巨噬细胞的增殖。
  • 内皮S1pr1通过细胞接触相互作用，通过Csf-1控制F4/80+Ly6clow巨噬细胞的增殖
    • 我们在体外测试了人脐静脉内皮细胞条件培养基对原代巨噬细胞增殖的影响。出乎意料的是，来自s1pr 1-过表达人脐静脉内皮细胞培养物的条件培养基对F4/80+Ly6clow巨噬细胞的体外产生没有影响(图5A)，这表明内皮细胞可能不会通过S1P/S1PR1信号传导分泌因子以旁分泌方式影响F4/80+Ly6clow巨噬细胞的产生。
    • 先前的一项研究报告说，内皮细胞为巨噬细胞的生长和分化提供了关键信号，这取决于细胞与内皮的物理接触。5我们确实观察到许多巨噬细胞在体内梗死周围心肌中紧密定位于内皮细胞(图5B)。我们的数据显示，在WT和S1pr1ECKO小鼠中，分别有47.02% 10.48%和38.04% 13.09%(平均标准差)的巨噬细胞与内皮细胞接触，这些小鼠从巨噬细胞到内皮细胞的距离没有统计学差异(补充资料在线，图S5G和H)。
    • 我们接下来测试了内皮细胞是否可能通过直接细胞接触影响F4/80+Ly6clow巨噬细胞。我们量化了WT和S1pr1ECKO小鼠中巨噬细胞到内皮细胞的距离。我们在体外将脾细胞来源的巨噬细胞直接与内皮细胞单层共培养，结果显示S1PR1过表达的人脐静脉内皮细胞显著增强F4/80+Ly6clow巨噬细胞的产生和增殖(图5C和d)。
    • 据报道，内皮细胞以直接细胞接触的方式通过Csf-1促进F4/80+Ly6clow巨噬细胞增殖。5然后我们考虑了EC-S1P 1是否影响CSF1的表达，从而控制F4/80+Ly6clow巨噬细胞增殖。正如预期的那样，我们的结果显示Csf-1信号的抑制阻断了EC-S1PR1过表达对F4/80+Ly6ClW巨噬细胞增殖的增强作用，如流式细胞分析所示(图5E和图5F)。
    • 为了研究内皮S1PR1是否影响人单核细胞，我们将s1p R1-过表达的人血管内皮细胞与人单核细胞株THP-1共培养，我们的结果显示s1p R1-过表达的人血管内皮细胞显著增强了THP-1巨噬细胞向M2巨噬细胞的分化，如CD206表达的上调所示，并且CSF-1信号抑制剂逆转了EC-S1PR1对巨噬细胞分化的增强作用(在线补充材料，图S5I)。不出所料，EC-S1PR1显著增强了THP-1巨噬细胞增殖，而CSF-1信号抑制剂降低了细胞增殖(在线补充资料，图S5J)。
    • 已经表明，S1P通过S1PR1激活了各种细胞类型中的ERK信号通路，包括中国仓鼠卵巢细胞、神经干细胞和肺成纤维细胞。14–16为了测试ECs中的S1P/S1PR1刺激是否能增强ERK活性，我们进行了蛋白质印迹分析，结果表明S1P处理显著增加了S1PR1过表达的人脐静脉内皮细胞中的磷酸化ERK水平，但在S1PR1沉默的人脐静脉内皮细胞中的磷酸化ERK水平要低得多，这表明S1P可能通过S1PR1激活了内皮细胞中的ERK信号通路我们的进一步实验表明，通过EC-S1PR1过表达增强的CSF1 mRNA和蛋白表达依赖于ERK信号通路，如定量实时PCR和蛋白质印迹分析所示(图5H andI)。
    • 我们进一步观察到，与WT小鼠相比，在MI后5天，S1pr1ECKO小鼠的心脏中CSF1表达水平下调(图5J)。
    • 因此，这些结果表明EC-S1PR1可能以细胞接触方式通过ERK-CSF1途径调节F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞增殖。
    • 
  • S1PR1的药理激活促进F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞的增殖，改善心肌梗死后的心脏重构
    • 接下来，我们测试了S1PR1的药理学激活是否能够促进修复性巨噬细胞积聚，进而改善MI后的病理性心脏重构。如预期，sew 2871(5mg/kg/天)对S1PR1进行4周的药理学激活，显著减小了纤维化瘢痕大小(图6A-C)，并显著增加了MI后的LV心肌收缩力(图6D安得)。为了进一步阐明S1 p1r 1激动剂对MI后心脏重构的作用是否依赖于内皮S1P/S1 p1r 1途径，我们用SEW2871对S1pr1ECKO小鼠进行了治疗。我们的研究显示，在用SEW2871治疗的小鼠中，MI后28天EC-S1PR1缺失增加了纤维化瘢痕大小，降低了LV心肌收缩力(图6A-C)，这表明EC-S1PR1缺失阻断了S1PR1激动剂对MI后心脏的有益作用，并且内皮S1P/S1PR1信号对于S1PR1激动剂对MI后心脏重构的作用是必不可少的。为了研究SEW2871对MI后心脏重构和功能的影响是否依赖于CSF1信号通路，我们用GW2580 (CSF1受体抑制剂)对小鼠进行了治疗。我们的数据显示，在接受SEW2871治疗的小鼠中，对CSF1信号通路的抑制逆转了SEW2871对MI后心脏纤维化和心脏功能下降的抑制效应(图6C-E)，这表明CSF1信号通路与SEW2871对MI后心脏重塑和功能的影响有关。此外，S1PR1的药理学激活在MI后3天适度增强心肌中的Mo/Mϕϕinfiltration，如F4/80的免疫染色所示(在线补充材料，图S6A和b)，并且显著增加F4/80+Ly6clow修复性巨噬细胞的量并在MI后7天增强其增殖(图7A和b)。如预期，SEW2871在MI后7天增强了心肌中修复性巨噬细胞相关细胞因子的表达水平(在线补充材料，图S6C)。GW2580 (CSF1受体抑制剂)对CSF1信号传导的阻断逆转了SEW2871对体内F4/80+Ly6clow巨噬细胞修复性增殖的增强效应(图7B)，这与我们的体外实验一致，表明S1PR1对F4/80+Ly6clow巨噬细胞增殖的效应依赖于CSF1途径。如预期，EC S1PR1缺乏和CSF1信号传导阻断会降低S1 P1 r 1激动剂增强的梗死边缘心肌的MI后血管生成，如MI后28天心脏的异链菌素-B4染色免疫染色所示(图7C)。总之，我们的结果表明，内皮S1PR1的激活可以通过刺激MI后的修复性巨噬细胞增殖来改善心脏重构。
    • 
• 讨论
  • 1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种重要的生物活性脂质，具有多效性细胞功能。6在脊椎动物中，细胞外S1P与细胞表面G蛋白偶联受体相互作用，控制许多细胞反应，包括细胞增殖、迁移、分化和凋亡。6，17 S1P有五种同源的G蛋白偶联受体，命名为S1 pr 1–5.17每个S1P受体与各种G蛋白偶联，并触发不同的信号通路，导致不同的细胞反应。6，17在心血管系统中，与S1P受体激活有关的效应影响不同的细胞类型，包括CMsS1 P1 R1在心脏的CMs和ECs中表达。18据报告，S1 P1 R1在CMs中的表达会作用于离子通道并赋予收缩反应选择性。18，19 Clay等人20应用Nkx2.5-cre和Mlc2a-cre小鼠在CMs中产生条件性敲除S1 P1 R1，并表明CM限制性S1 P1 R1缺失小鼠存在室间隔缺损和围产期致死性，这表明表达S1 P1 R1的CM对心脏发育至关重要。这些作者进一步表明，CM S1pr1-缺陷导致肌原纤维组织减少，这可能有助于CM-S1PR1对心脏发育的影响。20 Keul等人21使αMHC-cre小鼠与S1 P1 flox/flox小鼠杂交，在小鼠中产生S1 pr 1的心肌细胞限制性缺失，表现为进行性心肌病，并证明CM-S1PR1通过调节Ca2+敏感性和Na+/H+交换调节心脏功能，从而介导缺血预处理的保护作用。此外，研究显示，CMs中S1PR1与β肾上腺素能受体之间的串扰与S1PR1信号通路对心肌缺血的保护作用有关。22心肌细胞S1PR1迄今为止一直是MI后心肌病研究的压倒性重点；然而，EC-S1PR1在心脏损伤和重塑中的作用尚未被很好地理解。
  • EC-S1pr1对维持血管稳定性至关重要。23、S1pr1系统敲除突变体在e 12.5–14.5因血管形成缺陷导致致死性出血而死亡。23在小鼠胚胎发育期间，S1pr1在ECs中的特异性丢失导致内皮功能亢进和血管床中的血管渗漏。24 Ben Shoham等人，11，24表明EC-S1pr1通过稳定胚胎发育期间EC连接处的VE-cadherin来限制萌芽血管生成，从而防止过度的血管萌芽。研究显示，内皮S1PR1可调节一氧化氮信号，控制血管舒张至血流和血压同态。25在病理条件下，内皮S1PR1最有可能通过抑制白细胞粘附分子表达的内皮活化和调节内皮屏障完整性来介导急性肾损伤的保护和恢复。26，27在动脉粥样硬化过程中，内皮S1PR1通过促进细胞表面S1PR1-β-arrestin2复合物的形成和减弱促炎细胞因子TNFα激活NF-κB和增加的能力来延缓动脉粥样硬化的形成在EC-S1 P1 R1缺陷小鼠中，我们未观察到MI后血管生成增强，但在S1pr1ECKO小鼠的梗死周围心肌中观察到毛细血管形成减少。与我们的观察结果一致，Iwasawa等人29报告了S1 P1 R1激动剂SEW2871可能通过eNOS在急性缺血性卒中小鼠模型中促进缺血后血管生成和软脑膜侧支循环，这表明EC-S1 P1对缺血诱导的血管生成的作用不同于其对发育性血管生成的内在作用，如先前研究中所报告的。24这导致我们研究了EC-S1 P1 R1影响MI后心脏重构和心脏功能障碍的其他机制。24我们的进一步研究表明EC-S1 P1EC-s1pr 1-缺陷小鼠在MI的第二阶段表现出修复性Mϕ蓄积的急剧减少。众所周知，修复性巨噬细胞释放VEGF并增强MI后血管生成。30与此一致，我们在S1 P1 ecko小鼠的MI后心肌中检测到较少的修复性巨噬细胞和较少的VEGF表达水平，这解释了在S1 P1 ecko小鼠的梗死边缘区域观察到毛细血管密度降低的原因。我们的观察结果证明了心脏ECs调节MI后无菌性炎症和血管生成并促进心脏愈合的新机制。
  • 与以前的研究一致，3，4我们的数据证实了心肌梗死后心肌中Mo/Mϕ积聚的双相反应:在心肌梗死早期，Ly-6chigh单核细胞浸润到缺血心肌中，并且随着时间的推移，它们分化为Ly-6clow巨噬细胞，这在心肌梗死后期占主导地位。值得注意的是，正如我们和其他研究报告的那样，Ly-6clow巨噬细胞不仅来源于单核细胞分化，还来源于巨噬细胞的自我补充。4最近的研究表明，血管内皮细胞为巨噬细胞的分化和增殖提供了有益的生态位。5 He等人的研究表明，内皮单层支持巨噬细胞的扩张，并进一步促进其在体外向促血管生成表型的极化，这意味着血管内皮微环境可能在组织巨噬细胞增殖的调节中发挥重要作用，从而影响体内的组织重塑。在此，我们提供了体内证据，表明EC-S1pr1严格调节心肌梗死后局部F4/80+Ly-6Clow巨噬细胞的增殖，有助于改善不良心脏重构和增强心肌梗死后血管生成。he等还报道了巨噬细胞和内皮细胞之间的直接接触对于体外诱导巨噬细胞集落和M2样极化是必要和充分的。5与He等的s5报告一致，我们的体外共培养实验表明，巨噬细胞和内皮细胞之间的直接细胞接触是EC-S1pr1对巨噬细胞增殖的增强作用所必需的，这表明EC-S1P/S1PR1以直接细胞接触的方式而不是旁分泌的方式增强巨噬细胞增殖。我们的进一步数据表明，内皮细胞中S1PR1的激活通过ERK信号通路上调了CSF1的表达，并且EC-CSF1促进了修复性巨噬细胞的增殖。这项研究通过调节组织局部修复性巨噬细胞的自我补充，强调了局部血管微环境在组织炎症和重塑中的重要性。除了向心肌细胞输送氧气和营养物质的内皮细胞功能外，我们的研究表明，心脏内皮细胞形成了一个有指导意义的血管生态位来调节巨噬细胞反应，从而影响心肌梗死后的心脏重塑(在线补充材料，图S7)。综上所述，我们的研究表明ECs通过S1P/S1PR1/CSF1途径以细胞接触的方式严格控制心肌修复后Mo/Mϕ细胞的增殖。这意味着可行的血管生态位信号调节可能为解决过度炎症和改善心梗后不利的心脏重构提供一个有希望的靶点。

Kuang Y, Li X, Liu X, et al. Vascular endothelial S1pr1 ameliorates adverse cardiac remodelling via stimulating reparative macrophage proliferation after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2021;117(2):585-599. doi:10.1093/cvr/cvaa046